miRNA茎环逆转录与荧光定量常见问题

　　miRNA茎环法适合用于少量目的miRNA的精确定量检测，相比于加尾法，检测灵敏度、特异性和精准度都更高，下面跟着小编一起来学习吧！

　　该原理是利用一种稳定的双链结构--茎环（stem-loop）结构作为逆转录引物，与miRNA中目标序列互补结合，形成DNA/RNA复合体，随后利用逆转录酶将RNA序列逆转录为cDNA，从而实现miRNA表达的测量和分析等功能。下图所示即是miRNA茎环法原理及过程哦~

　　接下来，我们一起来看一下miRNA茎环法逆转录与荧光定量有哪些常见问题：

　　研究者对实验结果的精确度有高要求时，建议选择miRNA茎环法逆转录和荧光定量。茎环法最大的特点就是其逆转录和qPCR都是序列特异性的，对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的逆转录引物以及qPCR引物，建议找设计经验丰富的生物公司进行设计如百代生物等，搭配其BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒与荧光定量试剂盒一起使用，可确保实验结果的特异性和灵敏度。尤其是其中针对性设计的茎环逆转录引物，一方面能够有效延长miRNA长度，另一方面又可利用自身的互补构象防止与其他序列结合，从而减少了非特异结合，提高实验结果的精确度，并且百代生物还可免费提供miRNA上下游引物的设计合成服务。

　　1.延长方式不同：加尾法是对所有miRNA无差别化加上polyA尾巴来延长cDNA长度，而茎环法是通过设计带有茎环结构的引物与目的miRNA特异性结合来进行延长；

　　2.适用的实验需求不同：加尾法属于高通量逆转录，适用于大量miRNA的筛选检测；而茎环法属于特异性逆转录，适用于少量目标miRNA的精确定量检测；

　　另外，miRNA茎环法的检测灵敏度、特异性、精确度都要优于加尾法，研究者需要根据具体实验需求选择最合适的方法。

　　3、miRNA采用茎环法进行逆转录时，可以在一管中同时添加多个逆转录引物吗?

　　不建议！如若研究多个目的miRNA，则每个miRNA都需要分开进行逆转录，否则在一管中同时投入多个茎环引物进行多个miRNA逆转时，不同特异性茎环引物的茎环结构之间会产生相互干扰和影响。

　　但BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒有一些特别的设计，可在同一个逆转录体系中同时添加U6（内参）逆转录引物和茎环逆转录引物，两者可同时进行逆转录，而不会出现相互干扰和影响的问题。